Simulation: Elektrophorese von Aminosäuren

Elektrophorese von Aminosäuren

Aminosäure-Teilchen im elektrischen Feld

Aminosäuren sind Ampholyte: Die Carboxygruppe kann ein Proton abgeben, die Aminogruppe ein Proton aufnehmen. Je nach pH-Wert liegen die Teilchen als Kation, Zwitterion oder Anion vor. Das Zwitterion trägt eine positiv geladene Ammonium-Gruppe und eine negativ geladene Carboxylat-Gruppe; seine Gesamtladung ist null.

Isoelektrischer Punkt (IEP): der pH-Wert, bei dem die Aminosäure-Teilchen überwiegend als Zwitterionen vorliegen; Kationen und Anionen sind im Verhältnis 1 : 1 vorhanden. Er ist bei jeder Aminosäure anders (Glutaminsäure 3,22, Glycin 5,97, Histidin 7,53, Lysin 9,59) und nicht der Neutralpunkt.

Positiv geladene Teilchen wandern zur Kathode (Minuspol), negativ geladene zur Anode (Pluspol). Daraus folgt:

• pH < IEP: mehr Kationen als Anionen – die Aminosäure wandert zur Kathode.
• pH > IEP: mehr Anionen als Kationen – die Aminosäure wandert zur Anode.
• pH = IEP: Die Aminosäure wandert nicht.

Elektrophorese-Apparatur und Durchführung

• Ein Trägerstreifen (Celluloseacetat-Folie oder Filterpapier) wird mit Pufferlösung getränkt und auf eine Auflage gelegt.
• Seine Enden tauchen in zwei Kammern mit Pufferlösung, in denen die Elektroden stehen. Ein Deckel verringert das Verdunsten.
• Die Proben werden auf der Startlinie aufgetragen, dann wird eine Gleichspannung angelegt.

Die Pufferlösung leitet den Strom und hält den pH-Wert im ganzen Streifen konstant. So behält jede Aminosäure während des Laufs dieselben Anteile ihrer Ladungsformen.

Sichtbarmachen mit Ninhydrin

Aminosäure-Lösungen sind farblos. Nach dem Lauf wird der Streifen getrocknet, mit Ninhydrin-Lösung besprüht und erwärmt. Ninhydrin reagiert mit der Aminogruppe freier Aminosäuren zu einem blauvioletten Farbstoff: Violette Flecken zeigen, wo die Aminosäuren liegen. Das Bild der Flecken heißt Pherogramm.

Wanderungsrichtung und Wanderungsgeschwindigkeit

Jedes Teilchen nimmt ständig Protonen auf und gibt sie ab. Es liegt deshalb abwechselnd in den verschiedenen Formen vor – im zeitlichen Mittel mit den Anteilen, die zum pH-Wert gehören. Beispiel pH 6:

• Lysin: fast immer Kation (1+) – wandert schnell zur Kathode.
• Histidin: etwa die Hälfte der Zeit Kation (1+), sonst Zwitterion – wandert langsamer zur Kathode.
• Glutaminsäure: fast immer Anion (1−) – wandert zur Anode.
• Glycin: fast nur Zwitterion, Kationen und Anionen etwa im Verhältnis 1 : 1 (genau 1 : 1 am IEP, pH 5,97) – bleibt praktisch am Start.

Die elektrische Kraft wächst mit der Gesamtladung im zeitlichen Mittel und mit der Spannung. Die Reibung in der Pufferlösung bremst größere Teilchen stärker. Bei pH 10 ist ein Histidin-Teilchen zwar stärker negativ geladen als ein Glycin-Teilchen, wandert aber langsamer, weil es etwa doppelt so schwer ist. Durch Diffusion werden die Flecken mit der Zeit etwas breiter.

Trennung eines Gemischs

Ein Gemisch trennt sich, wenn die Aminosäuren beim gewählten pH-Wert verschieden schnell oder in verschiedene Richtungen wandern. Bei pH 6 trennen sich alle vier Aminosäuren; bei pH 2 wandern alle zur Kathode, nur verschieden weit. Liegt der pH-Wert zwischen den IEP zweier Aminosäuren, wandern sie in entgegengesetzte Richtungen.

Isoelektrische Fokussierung

Die isoelektrische Fokussierung ist eine Form der Elektrophorese mit einem pH-Gradienten im Trägerstreifen: An der Anode ist er sauer, zur Kathode hin steigt der pH-Wert an. Den Gradienten erzeugen Trägerampholyte, ein Gemisch vieler kleiner Ampholyte mit verschiedenen IEP.

• Prinzip: Jedes Teilchen wandert, bis es an die Stelle kommt, deren pH-Wert seinem IEP entspricht. Dort ist seine Gesamtladung im zeitlichen Mittel null.
• Fokussierung: Gerät ein Teilchen durch Diffusion auf die saure Seite, sind dort mehr Kationen als Anionen vorhanden, und es wandert in Richtung Kathode zurück; auf der basischen Seite wandert es in Richtung Anode zurück. Die Banden werden deshalb schärfer statt breiter.
• Auftragestelle: Weil jede Aminosäure ihren IEP von beiden Seiten erreicht, kann die Probe im Prinzip an jeder Stelle aufgetragen werden. In der Praxis trägt man sie meist nahe einem Ende des Gradienten auf, häufig auf der Anodenseite, oder verteilt sie im ganzen Gel. Trägt man dieselbe Probe an beiden Enden auf, zeigt das gleiche Ergebnis, dass die Fokussierung abgeschlossen ist.

Eingesetzt wird das Verfahren vor allem für Proteine. Freie Aminosäuren lassen sich so kaum untersuchen: Die Trägerampholyte sind selbst Aminocarbonsäuren und würden mit Ninhydrin mit angefärbt. Außerdem bildet Glycin keine scharfe Bande: Seine pK_S-Werte (2,34 und 9,60) liegen weit auseinander, zwischen etwa pH 4 und pH 8 liegen fast nur Zwitterionen vor. Glycin-Teilchen werden dort nur sehr langsam bewegt, während die Diffusion sie verteilt – es entsteht eine breite, unscharfe Zone um den IEP, und das dauert Tage. Lysin und Glutaminsäure, deren pK_S-Werte um den IEP eng beieinanderliegen, bilden dagegen schnell scharfe Banden.

Grenzen des Modells

• Die Anteile stammen aus den pK_S-Werten einer Schul-Datensammlung, gerechnet mit Konzentrationen statt Aktivitäten.
• Die Wanderungsgeschwindigkeit folgt einer Faustregel für kleine Ionen und Peptide: proportional zur Gesamtladung im zeitlichen Mittel und zur Spannung, umgekehrt proportional zur Masse hoch 2/3. Wechselwirkungen mit dem Trägermaterial fehlen.
• Diffusion und Fokussierung sind mit einem einfachen Ansatz gerechnet; die Breite der Flecken zeigt die Größenordnung.
• Die Flecken sind von Anfang an zu sehen; in Wirklichkeit werden sie erst nach dem Anfärben sichtbar.
• Nicht berücksichtigt: Elektroosmose (die Pufferlösung strömt im Streifen meist etwas zur Kathode), Erwärmung und Verdunstung.
• Isoelektrische Fokussierung: Spannung 3000 V; bei kleinerer Spannung würden alle Zonen breiter. Die Zeit läuft im Zeitraffer immer schneller, damit die ersten Minuten und die Tage bis zum Endzustand von Glycin zu sehen sind.
• Gezeigt werden nur die Aminosäure-Teilchen; außerdem liegen Wasser-Moleküle und die Ionen der Pufferlösung vor.